Il percorso espositivo prosegue con l’Annunciazione di un artista seguace di Memling, l’unico dipinto fiammingo di tematica religiosa presente in una struttura pubblica cittadina, residua ma significativa traccia delle molte opere nordeuropee giunte in città. La sala ospita anche le cinque ante lignee di bancone provenienti dalla sagrestia della Cattedrale di San Martino a Lucca, realizzate nella seconda metà del Quattrocento da Cristoforo Canozzi da Lendinara e, a seguire, diverse opere del maggiore artista lucchese del tempo, Matteo Civitali (Annunciazione, Madonna col Bambino, Ecce Homo, Vir dolorum). Accanto alle opere del Civitali è esposto un notevole esempio di arte orafa, la Croce astile realizzata da Francesco Marti, mentre sulla parete a destra tre pale d’altare di Michelangelo di Pietro Membrini, il più grande pittore lucchese del secolo XVI. Alle opere dei lucchesi Vincenzo Frediani e Zacchía da Vezzano sono accostati i lavori di due importanti artisti forestieri: Amico Aspertini, manierista bolognese cui si devono anche gli affreschi della Cappella Cenami in San Frediano, e Fra’ Bartolomeo autore dei due dipinti di maggior prestigio dell’intera collezione museale.

La sequenza della visita al primo piano del Museo si conclude con le splendide tarsíe lignee (Ambrogio Pucci, 1522) e i solidi scranni intagliati provenienti dalla Cappella di Palazzo degli Anziani di Lucca, cui fanno da sfondo le tre tele di Giorgio Vasari realizzate nel 1543 e provenienti dalla chiesa di San Pier Cígoli o del Carmine. L’esposizione prosegue al piano terreno con opere del periodo della Controriforma e si apre con le grandi pale d’altare realizzate a partire dalla seconda metà del Cinquecento dai numerosi artisti forestieri quali il Passignano e Federico Zuccari che realizzano tele per la chiesa di San Pietro Maggiore, demolita nel 1806 durante il principato di Elisa Baciocchi sorella di Napoleone. Da segnalare, oltre a una tela con Il battesimo di Cristo di Jacopo Ligozzi, l’Allegoria della libertà lucchese di Paolo Guidotti, un artista di origini lucchesi poi trasferitosi a Roma dove lavorò per il potente cardinale Scipione Borghese.